Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 16Autori Liu J, Fan G, Tao N, Feng F, Meng C, Sun TPubblicato il 13 giugno 2022 Volume 2022:16 Pagine 1793—1809DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S361748Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Jianbo SunJingjing Liu,1– 3 Guoqing Fan,1– 3 Ningning Tao,4 Feifei Feng,5 Chao Meng,1– 3 Tieying Sun1,2 1Dipartimento di medicina respiratoria e terapia intensiva, Ospedale di Pechino, Centro nazionale di gerontologia, Istituto di medicina geriatrica , Accademia cinese di scienze mediche, Pechino, Repubblica popolare cinese;2Scuola di specializzazione dell'Union Medical College di Pechino, Pechino, Repubblica popolare cinese;3The MOH Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Beijing, People's Republic of China;4Dipartimento di medicina respiratoria e terapia intensiva, ospedale provinciale di Shandong affiliato alla prima università medica di Shandong, Jinan, Shandong, Repubblica popolare cinese;5Dipartimento di medicina respiratoria e terapia intensiva, The Second Hospital, Cheeloo College of Medicine, Università di Shandong, Jinan, Shandong, Repubblica popolare cinese Corrispondenza: Tieying Sun, Dipartimento di medicina respiratoria e terapia intensiva, Ospedale di Pechino, Centro nazionale di gerontologia, Istituto di medicina geriatrica, Accademia cinese delle scienze mediche, Pechino, Repubblica popolare cinese, Tel +15153169108, e-mail [e-mail protetta] Scopo: la fibrosi polmonare idiopatica è una polmonite interstiziale fibrotica cronica e irreversibile di eziologia sconosciuta e le strategie terapeutiche sono limitate.Prove emergenti suggeriscono che l'attivazione continua dell'inflammasoma della proteina 3 (NLRP3) contenente l'oligomerizzazione legante nucleotide centrale, la ripetizione ricca di leucina e la proteina 3 (NLRP3) è coinvolta nella patogenesi della fibrosi polmonare.Il ginsenoside Rb1 (G-Rb1) è il componente più abbondante nel ginseng tradizionale cinese alle erbe e ha attività antinfiammatorie e antifibrotiche.Lo scopo di questo studio era di esplorare se G-Rb1 esercita attività antinfiammatorie e antifibrotiche in vivo e in vitro sopprimendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e della via NF-κB.Metodi: Quarantotto topi maschi C57BL/6 sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (n=12/gruppo) come segue: controllo, bleomicina (BLM), BLM/G-Rb1 e G-Rb1.Un modello di fibrosi polmonare è stato sviluppato tramite un'iniezione intratracheale di BLM.Sei topi di ciascun gruppo sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni 3 e 21. Il grado di fibrosi polmonare è stato esaminato mediante valutazione istologica e valutazione dei livelli di actina del muscolo liscio α.Le cellule THP-1 sono state differenziate in macrofagi e stimolate da lipopolisaccaride e adenosina trifosfato.L'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e del percorso NF-κB è stata determinata mediante Western blotting.I livelli di interleuchina-1 beta e interleuchina-18 sono stati misurati mediante ELISA.Le cellule MRC-5 sono state coltivate nel mezzo condizionato dei macrofagi trattati, dopodiché i marcatori dei miofibroblasti sono stati determinati mediante Western blotting.Risultati: G-Rb1 ha migliorato l'infiammazione polmonare e la fibrosi indotte da BLM nei topi e ha soppresso l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la via NF-κB nei tessuti polmonari.Inoltre, l'interleuchina-1 beta secreta dopo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi ha promosso la differenziazione dei fibroblasti.G-Rb1 ha inibito l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 indotta da lipopolisaccaridi e adenosina trifosfato nei macrofagi e ha disturbato il crosstalk tra macrofagi e fibroblasti.Conclusione: G-Rb1 migliora l'infiammazione polmonare e la fibrosi indotte da BLM sopprimendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la via NF-κB.Quindi, G-Rb1 è un potenziale nuovo farmaco terapeutico per la fibrosi polmonare idiopatica.Parole chiave: G-Rb1, fibrosi polmonare, inflammasoma NLRP3, macrofagiLa fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia fibrotica progressiva e irreversibile caratterizzata da danno delle cellule epiteliali alveolari, infiammazione cronica, un'insolita attivazione dei miofibroblasti e un'eccessiva deposizione di collagene.1-3 I pazienti con IPF hanno una prognosi complessivamente sfavorevole e un'elevata mortalità .4 Finora, l'unica terapia curativa efficace per l'IPF è stata il trapianto di polmone;tuttavia, l'alto costo di questa procedura e la mancanza di donatori ne limitano l'applicazione clinica.2 Inoltre, sebbene nintedanib e pirfenidone, che riducono la progressione dell'IPF, siano stati autorizzati, nessuno dei due può invertire l'esito dell'IPF.2 Pertanto, una nuova ricerca che chiarisce la patogenesi della fibrosi polmonare per scoprire nuovi farmaci terapeutici è urgente.L'inflammasoma è un complesso multiproteico intracellulare, costituito da una proteina sensore, una proteina adattatrice e la proteasi infiammatoria della famiglia delle caspasi-1.5 Più specificamente, il dominio centrale di oligomerizzazione legante il nucleotide, ripetizione ricca di leucina e pirina -l'inflammasoma contenente la proteina 3 (NLRP3) è l'inflammasoma meglio caratterizzato e ampiamente studiato.L'inflammasoma NLRP3 è innescato da microrganismi (ad es. batteri o virus), mediatori del danno endogeno (ad es. adenosina trifosfato [ATP] e specie reattive dell'ossigeno) e particelle estranee che fungono da piattaforma per l'attivazione della caspasi-1.6–8 Quindi, la caspasi-1 bioattiva scinde il precursore dell'interleuchina-1 beta (IL-1β) e dell'interleuchina-18 (IL-18) in forme mature.6 La via NF-κB è l'iniziatore a monte dell'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, che sovraregola la trascrizione di NLRP3 .9 L'inflammasoma NLRP3 è espresso in varie cellule immunitarie innate, comprese cellule dendritiche, macrofagi e cellule T.9 I macrofagi alveolari, in quanto cellule immunitarie residenti nel polmone, rilasciano una grande quantità di mediatori solubili profibrotici, chemochine, proteine ​​della matrice extracellulare, e metalloproteasi, che forniscono un ambiente extracellulare ai fibroblasti per differenziarsi in miofibroblasti.10-12 Prove emergenti hanno rivelato che l'inflammasoma NLRP3 è coinvolto nella patogenesi di lung fibrosi in modelli sperimentali e pazienti.5,13-15 Inoltre, l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei topi anziani aumenta la loro suscettibilità alla fibrosi polmonare, mentre, nei topi NLRP3-/-, la produzione di IL-1β e la progressione della fibrosi sono ridotte.13 IL-1β partecipa allo sviluppo della fibrosi polmonare, che promuove la produzione di TGF-β1.16 Inoltre, IL-1β guida la trasformazione e l'attivazione dei miofibroblasti e stimola l'espressione del collagene in vitro.17,18 Pertanto, sopprimendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in i macrofagi alveolari hanno il potenziale per diventare una strategia di trattamento fattibile per i pazienti con IPF.I ginsenosidi, una classe di saponine triterpeniche, sono i principali composti attivi nel ginseng tradizionale cinese alle erbe e il ginsenoside Rb1 (G-Rb1) è il composto attivo più abbondante tra i ginsenosidi bioattivi.19 Precedenti studi hanno dimostrato che G-Rb1 esercita un'azione anti -effetti fibrotici sul fegato e sui reni20,21 e sopprime il livello di collagene I.22 Inoltre, G-Rb1 attenua il danno polmonare acuto indotto dal lipopolisaccaride (LPS) attraverso la via NF-κB.23 Tuttavia, sebbene abbia un effetto protettivo del ginsenoside Rg1 , un ginsenoside di tipo protopanaxatriolo, contro la fibrosi indotta da bleomicina (BLM) è stato dimostrato nei ratti,24 l'efficacia del ginsenoside di tipo protopanaxadiolo G-Rb1 nella fibrosi polmonare indotta da BLM non è stata segnalata.Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato se G-Rb1 può alleviare la fibrosi polmonare sopprimendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3.La bleomicina (BLM) cloridrato è stata acquistata da Nippon Kayaku Co. Ltd. (Tokyo, Giappone).Il ginsenoside Rb1 è stato acquistato da Solarbio (Pechino, Cina).MCC950 è stato acquistato da APExBIO (Houston, TX, USA).LPS (Escherichia coli 0111: B4), ATP e phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).Gli anticorpi contro NLRP3 (ab263899), IL-1β (ab234437), pro-caspase-1 (ab179515) e fosfo-NF-κBS536 p65 (ab76302) sono stati acquistati da Abcam (Waltham, MA, USA).Gli anticorpi contro lo speck-like associato all'apoptosi (ASC) (# 67824), fosfo-IκBαSer32 (# 2859) e β-actina (# 4970) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).Anticorpi contro NF-κB p65 (10745–1), IκBα (10268–1), α-actina del muscolo liscio (α-SMA; 80008–1), collagene di tipo I (Col I) (66761–1) e CD11c ( 17342–1), così come gli anticorpi secondari sono stati acquistati da Proteintech (Rosemont, IL, USA).L'IL-1β umana ricombinante è stata acquistata da Proteintech.Il reagente di trasfezione Lipofectamine™ 3000 è stato acquistato da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).Il bromuro di tetrazolio blu di tiazolile, la soluzione di ematossilina-eosina (H&E) e il kit di colorazione tricromica di Masson e il kit di colorazione Giemsa sono stati acquistati da Solarbio.I kit IL-1β e IL-18 ELISA sono stati acquistati da R&D Systems (Wiesbaden-Nordenstadt, Germania).Il kit di dosaggio dell'idrossiprolina è stato acquistato da NanJing JianCheng Taihao Biotechnology (NanJing, Cina).Topi maschi C57BL/6 di otto settimane, del peso di circa 22 g sono stati ottenuti da SPF Biotechnology (Pechino, Cina).Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni standard di umidità, temperatura e luce (55 ± 5% di umidità, 22 ± 2 ℃, ciclo luce-buio di 12 ore, rispettivamente) e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua.Dopo una settimana di adattamento, 48 topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (12 topi per gruppo) come segue: gruppo di controllo (controllo);gruppo BLM (BLM);Gruppo BLM/G-Rb1 (BLM+G-Rb1);e gruppo G-Rb1 (G-Rb1).La fibrosi polmonare è stata iniziata tramite un'iniezione intratracheale di BLM (5 mg/kg, 50 μL), mentre ai gruppi di controllo e G-Rb1 è stata somministrata la stessa dose di soluzione fisiologica per via intratracheale.Ventiquattro ore dopo la provocazione BLM, i topi G-Rb1 (20 mg/kg, una volta al giorno) sono stati iniettati per via intraperitoneale ogni giorno fino all'eutanasia.Sei topi di ciascun gruppo sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni 3 e 21. Sono stati raccolti tessuti polmonari, siero e liquido di lavaggio bronco-alveolare (BALF) per ulteriori esperimenti.Le procedure che coinvolgono animali da esperimento sono state autorizzate dal Medical Ethics Committee del Second Hospital of Shandong University (KYLL-2019(KJ)A-0150) e condotte secondo l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) e l'Institutional Linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC).Le cellule THP-1 e le cellule MRC-5 sono state ottenute dal Peking Union Medical College.Le cellule THP-1 sono state coltivate in terreni RPMI 1640 (Gibco, Amarillo, TX, USA) con il 10% di siero bovino fetale (Gibco) e l'1% di penicillina e streptomicina.Le cellule MRC-5 sono state mantenute in terreno essenziale minimo con sali bilanciati di Earle (Gibco), siero bovino fetale al 10% e penicillina e streptomicina all'1%.Tutte le cellule sono state coltivate a 37 ℃ con il 5% di CO2.Le cellule THP-1 sono state differenziate in macrofagi aggiungendo PMA (100 ng/mL) per 24 ore in un mezzo privo di siero e sono state quindi utilizzate negli esperimenti successivi.I macrofagi sono stati pretrattati con o senza G-Rb1 (20 μM) per 24 ore o MCC950 (1 μM) per 1 ora, quindi stimolati con LPS (100 ng/mL) per 5,5 ore e ATP (5 mM) per 30 min o con il controllo del veicolo.L'estrazione proteica è stata eseguita per analisi Western blot.Il mezzo condizionato dei macrofagi trattati è stato sostituito con un mezzo di coltura fresco per 24 ore.Il mezzo condizionato ottenuto dai supernatanti cellulari è stato raccolto, centrifugato e miscelato con un mezzo di coltura fresco.Le cellule MRC-5 sono state coltivate nel mezzo condizionato;le cellule sono state raccolte dopo 48 ore per ulteriori esperimenti.siRNA (GenePharma, Shanghai, Cina) è stato utilizzato per abbattere l'espressione di NLRP3.La sequenza del siRNA NLRP3 era 5' CAACAGGAGAGACCUUUAUTT AUAAAGGUCUCUCCUGUUGTT 3'.I macrofagi sono stati trasfettati con siRNA di controllo o siRNA NLRP3 utilizzando Lipofectamine 3000. Le cellule trasfettate con siRNA NLRP3 sono state coltivate per 48 ore prima della stimolazione di LPS e ATP.Il knockdown di NLRP3 è stato confermato tramite l'analisi Western blot.I campioni di tessuto polmonare sono stati tagliati in sezioni da 5 μm e colorati con H&E e il kit di colorazione tricromica di Masson.I risultati della colorazione sono stati osservati al microscopio ottico (Olympus, Tokyo, Giappone).Il numero totale di cellule in BALF è stato contato dall'emocitometro.Il numero di neutrofili e macrofagi è stato contato dal kit Giemsa Stain.In breve, il tessuto polmonare raccolto il giorno 21 è stato omogeneizzato e valutato utilizzando un kit di analisi dell'idrossiprolina (NanJing Jiancheng Taihao Biotechnology).I macrofagi sono stati trattati come descritto sopra.Successivamente, le cellule sono state fissate e bloccate.Le cellule sono state incubate con anticorpi di coniglio anti-NF-κB p65 durante la notte a 4 ℃, seguite da successiva incubazione con anticorpi secondari marcati in modo fluorescente a 37 ℃ per 30 minuti.Infine, i nuclei sono stati colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo e osservati mediante microscopia a fluorescenza (Olympus).Le cellule MRC-5 sono state coltivate nel mezzo condizionato per 48 ore.Quindi, sono stati sottoposti a colorazione con immunofluorescenza come menzionato sopra.L'anticorpo primario anti-α-SMA di coniglio è stato utilizzato per la colorazione con immunofluorescenza.Le sezioni polmonari sono state deparaffinate e l'antigene è stato riparato con citrato di sodio e sigillato con albumina di siero bovino al 5%.Le sezioni sono state incubate con anticorpi anti-α-SMA di coniglio durante la notte a 4 ℃ e quindi con anticorpi secondari marcati in modo fluorescente a 37 ℃ per 30 minuti.I nuclei sono stati colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo e ripresi mediante microscopia a fluorescenza (Olympus).Gli anticorpi primari utilizzati per la co-localizzazione dell'immunofluorescenza delle sezioni di tessuto polmonare erano anti-CD11c di coniglio e anti-NLRP3 di topo.Le immagini sono state acquisite tramite microscopia a fluorescenza (Olympus).I livelli di IL-1β e IL-18 di BALF di topo e surnatanti cellulari sono stati determinati utilizzando kit ELISA (sistemi di ricerca e sviluppo).Le cellule THP-1 (1 × 104 cellule/pozzetto) sono state seminate su una piastra da 96 pozzetti.Le cellule sono state trattate con dimetilsolfossido allo 0,1% (controllo del veicolo) e con G-Rb1 a dosi diverse (0, 5, 10, 20, 40, 80, 160 e 320 μM) per 24 h.Le cellule sono state analizzate utilizzando un kit di analisi del bromuro di tetrazolio blu tiazolilico per determinare la vitalità cellulare.La densità ottica è stata misurata a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Thermo Fisher Scientific).I tessuti o le cellule polmonari sono stati lisati con un tampone di lisi RIPA integrato con inibitori della fosfatasi e della proteasi e quantificati utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Thermo Fisher Scientific).La proteina totale nel supernatante cellulare è stata estratta con acetone.Uguali quantità di proteine ​​sono state separate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e quindi trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene.Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% e quindi incubate con gli anticorpi primari contro β-actina, α-SMA, Col I, NLRP3, ASC, pro-caspase-1, IL-1β, fosfo-NF-κBS536 p65, NF -κB p65, fosfo-IκBαSer32 e IκBα.Le membrane sono state quindi incubate con anticorpi di capra anti-coniglio o di capra anti-topo coniugati con HRP.I risultati sono stati valutati utilizzando ImageJ (National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA).Tutti i dati da tre a sei esperimenti indipendenti sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e sono presentati come media ± errore standard della media.Il test t di Student con la correzione di Welch è stato applicato per confrontare due gruppi distinti.Le differenze nei confronti multipli sono state analizzate utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con la correzione del test post-hoc di Tukey per misurazioni ripetute.I valori di P <0,05 sono stati definiti statisticamente significativi.L'impatto terapeutico di G-Rb1 è stato esaminato utilizzando un modello murino di fibrosi e infiammazione polmonare indotta da BLM (Figura 1A).I topi sono stati iniettati con BLM attraverso le loro vie aeree per indurre l'infiammazione polmonare in 72 h.Secondo i risultati della colorazione H&E, il gruppo BLM ha mostrato grave alveolite, edema polmonare e grave infiltrazione di cellule infiammatorie rispetto al gruppo di controllo.La somministrazione di G-Rb1 ha ridotto notevolmente l'intensità di alveolite, edema e accumulo di cellule infiammatorie (Figura 1B).Il punteggio Szapiel è stato utilizzato per valutare il grado di alveolite nei campioni colorati con H&E.I risultati hanno mostrato che il gruppo BLM ha mostrato un'alveolite più grave rispetto al gruppo di controllo e che il trattamento con G-Rb1 ha alleviato l'alveolite grave (Figura 1C).Per valutare l'effetto antinfiammatorio di G-Rb1, abbiamo esaminato i livelli di citochine infiammatorie nel BALF.L'ELISA ha dimostrato che i livelli di citochine, compresi quelli di IL-1β e IL-18, nel BALF erano più elevati nel gruppo BLM rispetto al gruppo di controllo.Il trattamento con G-Rb1 ha ridotto i livelli del mediatore infiammatorio indotti da BLM (Figura 1D).Inoltre, abbiamo rilevato il conteggio totale delle cellule e le classificazioni delle cellule nel BALF.Il trattamento con G-Rb1 ha anche ridotto il conteggio cellulare totale e il numero di macrofagi e neutrofili nel BALF (Figura 1E).Figura 1 Il ginsenoside Rb1 attenua l'infiammazione polmonare indotta da BLM nei topi il giorno 3. (A) Quarantotto topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (n=12): gruppo di controllo (controllo);gruppo BLM (BLM);Gruppo BLM/ginsenoside Rb1 (BLM+G-Rb1);gruppo ginsenoside Rb1 (G-Rb1).I topi sono stati iniettati per via intratracheale con soluzione fisiologica o bleomicina (BLM, 5 mg/kg, 50 μL) il giorno 0. Ventiquattro ore dopo l'istituzione del modello, i topi sono stati trattati con G-Rb1 (20 mg/kg) ogni giorno fino a quando non sono stati soppressi.Sei topi in ciascun gruppo sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni 3 e 21. (B) Colorazione ematossilina-eosina (H&E) dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(C) Punteggio Szapiel del tessuto polmonare nei topi (n = 6).(D) I livelli di IL-1β e IL-18 nel topo BALF sono stati misurati utilizzando ELISA (n = 6).(E) Numero totale di cellule, macrofagi e neutrofili in BALF.(n=6, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Figura 1 Il ginsenoside Rb1 attenua l'infiammazione polmonare indotta da BLM nei topi il giorno 3. (A) Quarantotto topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (n=12): gruppo di controllo (controllo);gruppo BLM (BLM);Gruppo BLM/ginsenoside Rb1 (BLM+G-Rb1);gruppo ginsenoside Rb1 (G-Rb1).I topi sono stati iniettati per via intratracheale con soluzione fisiologica o bleomicina (BLM, 5 mg/kg, 50 μL) il giorno 0. Ventiquattro ore dopo l'istituzione del modello, i topi sono stati trattati con G-Rb1 (20 mg/kg) ogni giorno fino a quando non sono stati soppressi.Sei topi in ciascun gruppo sono stati sottoposti a eutanasia nei giorni 3 e 21. (B) Colorazione ematossilina-eosina (H&E) dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(C) Punteggio Szapiel del tessuto polmonare nei topi (n = 6).(D) I livelli di IL-1β e IL-18 nel topo BALF sono stati misurati utilizzando ELISA (n = 6).(E) Numero totale di cellule, macrofagi e neutrofili in BALF.(n=6, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Abbiamo ulteriormente esplorato se G-Rb1 può inibire l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3.I livelli di espressione di NLRP3, ASC, caspase-1 p10 e pro-IL-1β sono aumentati significativamente nei polmoni il giorno 3 dell'esposizione a BLM rispetto a quelli del gruppo di controllo (Figura 2A).Rispetto al gruppo BLM, i livelli di NLRP3, ASC, caspase-1 p10 e pro-IL-1β sono stati notevolmente inibiti nel gruppo G-Rb1 (Figura 2A e B).Figura 2 Il ginsenoside Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la via NF-κB nell'infiammazione polmonare indotta da BLM nei topi il giorno 3. (A) L'espressione di NLRP3, ASC, caspase-1, caspase-1 p10 e pro IL-1β nei tessuti polmonari, misurati mediante Western blotting (n=6).(C) Co-localizzazione dell'immunofluorescenza di NLRP3 e CD11c.(D) L'espressione di IκBα e NF-κB fosforilato p65 nei tessuti polmonari, misurata mediante Western blotting (n = 6).(B) (E) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in (A) e (D).(n=6, *P < 0,05, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Figura 2 Il ginsenoside Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la via NF-κB nell'infiammazione polmonare indotta da BLM nei topi il giorno 3. (A) L'espressione di NLRP3, ASC, caspase-1, caspase-1 p10 e pro IL-1β nei tessuti polmonari, misurati mediante Western blotting (n=6).(C) Co-localizzazione dell'immunofluorescenza di NLRP3 e CD11c.(D) L'espressione di IκBα e NF-κB fosforilato p65 nei tessuti polmonari, misurata mediante Western blotting (n = 6).(B) (E) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in (A) e (D).(n=6, *P < 0,05, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Per chiarire ulteriormente la fonte cellulare dell'inflammasoma NLRP3 nei polmoni fibrotici indotti da BLM, abbiamo esaminato la co-localizzazione di NLRP3 con il marcatore dei macrofagi alveolari CD11c mediante immunofluorescenza.La colorazione NLRP3 era altamente colocalizzata con i macrofagi alveolari CD11c+ nei polmoni dei topi BLM (Figura 2C).I risultati hanno confermato che NLRP3 era localizzato principalmente nei macrofagi alveolari nella fibrosi polmonare indotta da BLM.Per caratterizzare ulteriormente il meccanismo molecolare mediante il quale G-Rb1 inibisce l'infiammazione e l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3, abbiamo studiato il percorso IκBα/NF-κB nei topi BLM.Dopo la stimolazione BLM, la fosforilazione di IκBα e NF-κB p65 è aumentata ovviamente e il trattamento G-Rb1 ha inibito la fosforilazione rispetto a quella successiva al trattamento BLM (Figura 2D ed E).Più emorragia vascolare, accumulo eccessivo di collagene e struttura alveolare caotica sono stati osservati nel gruppo BLM rispetto al gruppo di controllo, mentre il trattamento G-Rb1 ha comportato una notevole riduzione dell'infiammazione e della fibrosi (Figura 3A).Inoltre, l'evidente accumulo di collagene nei tessuti polmonari dopo la stimolazione BLM è stato rilevato utilizzando la colorazione tricromica di Masson, mentre la somministrazione di G-Rb1 ha attenuato la distruzione delle strutture alveolari e l'accumulo di collagene (Figura 3B).Il punteggio di Ashcroft è stato utilizzato per valutare il grado di infiammazione polmonare e fibrosi nei campioni colorati con H&E e tricromi di Masson.I risultati del punteggio semiquantitativo di Ashcroft hanno mostrato che il grado di fibrosi polmonare nel gruppo BLM era significativamente superiore a quello nel gruppo di controllo, mentre la somministrazione di G-Rb1 alleviava efficacemente la fibrosi polmonare (Figura 3C).L'α-SMA, come tipico marcatore di fibrosi, è stato rilevato mediante Western blotting e colorazione con immunofluorescenza.Il livello di α-SMA è aumentato notevolmente nei polmoni dei topi nel gruppo BLM rispetto a quello nel gruppo di controllo, che è stato bloccato da G-Rb1 (Figura 3D ed E).Il contenuto di idrossiprolina nel tessuto polmonare, che può riflettere il grado di fibrosi polmonare, era significativamente più alto nei topi del gruppo BLM rispetto agli animali del gruppo di controllo, che era bloccato da G-Rb1 (Figura 3F).L'espressione di IL-1β e IL-18 nel BALF dal gruppo BLM il giorno 21 era significativamente superiore a quella del gruppo di controllo, mentre il trattamento con G-Rb1 ha ridotto i livelli di citochine (Figura 3G).Figura 3 Il ginsenoside Rb1 attenua la fibrosi polmonare indotta da BLM.I topi sono stati soppressi il giorno 21. (A) Colorazione H&E dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(B) colorazione tricromica di Masson dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(C) Valutazione semiquantitativa della fibrosi polmonare in base al punteggio di Ashcroft (n = 6).(D) (E) L'espressione di α-SMA nei tessuti polmonari è stata valutata mediante Western blotting e immunofluorescenza (n = 6).(F) Il contenuto di idrossiprolina nei tessuti polmonari (n = 6).(G) I livelli di IL-1β e IL-18 di BALF sono stati valutati utilizzando ELISA.(n=6, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Figura 3 Il ginsenoside Rb1 attenua la fibrosi polmonare indotta da BLM.I topi sono stati soppressi il giorno 21. (A) Colorazione H&E dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(B) colorazione tricromica di Masson dei tessuti polmonari.Barra della scala: 100 μm.(C) Valutazione semiquantitativa della fibrosi polmonare in base al punteggio di Ashcroft (n = 6).(D) (E) L'espressione di α-SMA nei tessuti polmonari è stata valutata mediante Western blotting e immunofluorescenza (n = 6).(F) Il contenuto di idrossiprolina nei tessuti polmonari (n = 6).(G) I livelli di IL-1β e IL-18 di BALF sono stati valutati utilizzando ELISA.(n=6, **P< 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).I livelli di espressione di NLRP3, ASC, caspase-1 p10 e pro-IL-1β sono stati significativamente aumentati nei polmoni dei topi 21 giorni dopo la somministrazione di BLM rispetto a quelli del gruppo di controllo (Figura 4A, B).Inoltre, l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 è stata notevolmente bloccata dalla somministrazione di G-Rb1 nei tessuti polmonari.Coerentemente con ciò, la fosforilazione di IκBα e NF-κB p65 è aumentata in modo significativo, mentre il trattamento con G-Rb1 ha invertito questo effetto (Figura 4C e D).Pertanto, è stato ipotizzato che G-Rb1 potesse sopprimere la fibrosi indotta da BLM sopprimendo l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la via di segnalazione NF-κB.Figura 4 G-Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 indotta da BLM e il percorso NF-κB nei polmoni il giorno 21. (A) Western blot rappresentativi di NLRP3, ASC, caspase-1, caspase-1 p10 e pro IL-1β espressione nei tessuti polmonari (n=6).(C) Macchie occidentali rappresentative della fosforilazione di IκBα e NF-κB p65 nei tessuti polmonari (n = 6).(B) (D) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in A e C. (n = 6, * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001).Figura 4 G-Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 indotta da BLM e il percorso NF-κB nei polmoni il giorno 21. (A) Western blot rappresentativi di NLRP3, ASC, caspase-1, caspase-1 p10 e pro IL-1β espressione nei tessuti polmonari (n=6).(C) Macchie occidentali rappresentative della fosforilazione di IκBα e NF-κB p65 nei tessuti polmonari (n = 6).(B) (D) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in A e C. (n = 6, * P < 0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001).Per verificare ulteriormente il meccanismo di come G-Rb1 influenza l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in vitro, l'effetto di diverse concentrazioni di G-Rb1 sulla vitalità cellulare THP-1 è stato valutato utilizzando un saggio di bromuro di tetrazolio blu tiazolil (Figura 5A).I risultati hanno mostrato che G-Rb1 non era citotossico per le cellule THP-1 a dosi inferiori a 20 μM ma era leggermente tossico a dosi superiori a 40 μM.Pertanto, la concentrazione di G-Rb1 di 20 μM è stata selezionata per ulteriori esperimenti.I macrofagi sono stati esposti a LPS e ATP per attivare l'inflammasoma NLRP3.Come previsto, dopo la stimolazione di LPS e ATP, il livello di NLRP3 nelle cellule è aumentato e l'abbondante caspasi-1 scissa è stata rilevata nei supernatanti cellulari, che è stata bloccata da G-Rb1 (Figura 5B e C).Di conseguenza, IL-1β scisso più maturo era presente nei supernatanti cellulari esposti a LPS/ATP, mentre il pretrattamento G-Rb1 inibiva il rilascio di IL-1β scisso (Figura 5D).Pertanto, i nostri risultati hanno suggerito che il pretrattamento con G-Rb1 inibiva l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e la secrezione di IL-1β.La Figura 5 G-Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi.(A) Effetto di G-Rb1 a varie dosi sulla vitalità delle cellule THP-1.(B) Western blot rappresentativi di NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 p10, pro-IL-1β e IL-1β scisso.(C) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in B. (D) livelli di IL-1β nei supernatanti cellulari, rilevati mediante ELISA.(n≥3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).La Figura 5 G-Rb1 inibisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi.(A) Effetto di G-Rb1 a varie dosi sulla vitalità delle cellule THP-1.(B) Western blot rappresentativi di NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 p10, pro-IL-1β e IL-1β scisso.(C) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in B. (D) livelli di IL-1β nei supernatanti cellulari, rilevati mediante ELISA.(n≥3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001).Per dimostrare ulteriormente l'effetto di G-Rb1 sulla via NF-κB in vitro, abbiamo studiato l'espressione di IκBα e NF-κB p65 nelle cellule THP-1 dopo stimolazione LPS/ATP.Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di espressione proteica di IκBα e NF-κB p65 fosforilati sono aumentati notevolmente nelle cellule THP-1 stimolate da LPS/ATP e questo effetto è stato soppresso da G-Rb1 (Figura 6A e B).Per chiarire ulteriormente il meccanismo molecolare mediante il quale G-Rb1 ha inibito la via NF-κB, è stata studiata la traslocazione nucleare di NF-κB p65, che è un marker dell'attivazione di NF-κB, utilizzando l'immunofluorescenza.Le immagini di immunofluorescenza hanno mostrato che la traslocazione nucleare di NF-κB p65 è aumentata dopo la stimolazione LPS/ATP, mentre il pretrattamento con G-Rb1 ha ridotto significativamente la traslocazione nucleare indotta da LPS/ATP di NF-κB p65 dal citoplasma (Figura 6C).Abbiamo anche confrontato gli effetti di G-Rb1 e MCC950 sul percorso NF-κB.Il pretrattamento con MCC950 non ha avuto effetti inibitori sulla fosforilazione di IκBα e NF-κB p65 (Figura 6D ed E).La Figura 6 G-Rb1 sopprime la via NF-κB nei macrofagi mentre MCC950 non ha alcun effetto inibitorio sulla via NF-κB.(A) (D) Western blot rappresentativi di pIκBα/IκBα e pNF-κB p65/NF-κB p65.(B) (E) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in (A) e (D).(C) Traslocazione nucleare di NF-κB p65 nei macrofagi esaminati mediante immunofluorescenza.(n≥3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).La Figura 6 G-Rb1 sopprime la via NF-κB nei macrofagi mentre MCC950 non ha alcun effetto inibitorio sulla via NF-κB.(A) (D) Western blot rappresentativi di pIκBα/IκBα e pNF-κB p65/NF-κB p65.(B) (E) Analisi quantitativa dei Western blot mostrati in (A) e (D).(C) Traslocazione nucleare di NF-κB p65 nei macrofagi esaminati mediante immunofluorescenza.(n≥3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).Il mezzo condizionato è stato applicato per valutare l'influenza dei macrofagi sulla differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti (Figura 7A).La differenziazione delle cellule MRC-5 in miofibroblasti è stata osservata dopo che sono state stimolate utilizzando il mezzo condizionato.Il risultato è stato supportato dall'aumento dei livelli di α-SMA e collagene I (Figura 7B e C).Inoltre, il pretrattamento con G-Rb1 ha trattenuto il crosstalk tra macrofagi e fibroblasti.Questi risultati hanno mostrato che l'inflammasoma NLRP3 nei macrofagi promuoveva la differenziazione dei fibroblasti e G-Rb1 inibiva il crosstalk tra macrofagi e fibroblasti.La figura 7 G-Rb1 attenua la differenziazione dei miofibroblasti indotta dai macrofagi dei fibroblasti.(A) Illustrazione del mezzo condizionato.Le cellule THP-1 sono state differenziate in macrofagi.Le cellule sono state pretrattate con o senza G-Rb1 e quindi stimolate con LPS e ATP o il controllo del veicolo.Il mezzo condizionato è stato quindi raccolto e diluito per la coltura delle cellule MRC-5.(B) L'espressione di α-SMA e collagene I nelle cellule MRC-5 esposte al mezzo condizionato, rilevate mediante Western blotting.Tutti i diritti riservati.